近日，大连理工大学环境学院吕红副教授与中科院烟台海岸带研究所张海坤副研究员合作，在环境领域权威期刊Environmental Science & Technology上发表了题为“Insights into the Direct Photoelectron Transfer Mechanism in Cofactor-free Redox Carbon Dots and Cytochrome c Nitrite Reductase Biohybrids Responsible for Ammonia Synthesis”的研究论文。该论文构建了一种无细胞的NrfA/R-CDs光敏生物杂合系统，探讨了NrfA与氧化还原性碳点(R-CDs)之间的界面光电子转移过程，并揭示了R-CDs介导直接光电子转移的关键结构。

研究背景

相比哈伯-博世人工合成氨，微生物异化硝酸盐还原成铵(DNRA)具有温和和选择性高的特点。细胞色素c亚硝酸还原酶(NrfA)作为DNRA过程的限速酶，可催化六电子的亚硝酸还原为铵过程。在Shewanella oneidensis MR-1等DNRA细菌中，NrfA通常与膜结合的氧化还原伴侣(CymA)形成复合物，后者从电子传递链中的甲萘醌中获取电子，这种代谢方式涉及多种酶催化。由于微生物电子传递速度较慢，通常导致NH₄⁺  产量较低。半人工光合作用结合了光催化剂的光吸收能力和酶的生物催化作用。这种方法可以再生NAD(P)H和还原型甲基紫精(MV^•+)等辅因子，或直接向酶提供光电子。然而，辅因子与酶活性位点之间的间接电子转移过程和非特异性相互作用往往会导致电子传递效率的损失。可见，直接电子传递过程可获得更高的效率。在前期的研究中，我们发现菌株MR-1和R-CDs组成的全细胞杂合系统中(10.1016/j.biortech.2024.131539)，R-CDs被证实可进入菌株MR-1内部，并提供短程光电子转移途径，提高NH₄⁺的产量。

研究内容

为揭示R-CDs与NrfA蛋白之间的具体相互作用和光电子转移过程，本文采用异源表达方法表达和纯化出了NrfA蛋白，然后构建了一种无细胞的NrfA/R-CDs光敏生物杂合系统。NrfA/R-CDs杂合系统中最大NH₄⁺产率可达到12.5 ± 1.1 μmol (NH₄⁺)·mg^-1 (NrfA)·h^-1，NH₄⁺选择性为93.3%。琼脂糖凝胶电泳、CLSM、光电测试和荧光测试结果表明NrfA和R-CDs之间存在良好的亲和性，NrfA的加入可以提升R-CDs的电子-空穴对的分离效率，使光电流强度增强2.5倍，荧光寿命从5.2 ns增加至6.9 ns。R-CDs表面的C=O结构不仅有助于促进R-CDs与NrfA的相互作用，还可以捕获导带中的光电子。并且发现，即使在黑暗条件下，R-CDs储存的大部分光电子(84.0%)也可以直接传递给NrfA。分子对接和分子动力学(MD)模拟结果表明，R-CDs可与NrfA的Heme 2区域形成稳定的复合物(结合亲和力为-16.9 kcal·mol^-1)，由于较短的电子传输距离(10 Å)及π-电子相互作用，这些储存的π电子可直接转移给NrfA的Heme 2结构，并最终转移到活性位点Heme 1上用于合成NH₄⁺。

图1 (a) NrfA浓度对光催化系统产NH₄⁺的影响；(b) R-CDs浓度对光催化系统产NH₄⁺的影响；(c) TEOA浓度对光催化系统产NH₄⁺的影响；(d)不同光催化系统的NH₄⁺生产情况

图2 (a, b) R-CDs、NrfA和NrfA/R-CDs复合物在365 nm紫外光下的琼脂糖凝胶电泳图像。(c)经考马斯亮蓝染色后的琼脂糖凝胶电泳图像。(d) NrfA/R-CDs复合物的CLSM图像：(I) R-CDs的荧光图像(Ex 405 nm/Em 440-480 nm)；(II) FITC标记的NrfA荧光图像(Ex 488 nm/Em 510-550 nm)；(III)上述两幅图像的合并图像。(e, f)光还原后NrfA的紫外-可见吸收光谱

图3 (a, b) NrfA/R-CDs复合物分子对接模型的最佳姿态；(c) MD过程中NrfA和NrfA/R-CDs复合物的RMSD变化；(d) MD过程中NrfA和NrfA/R-CDs复合物的Rg变化

图4 (a) MD过程中NrfA和NrfA/R-CDs复合物的RMSF值；(b) RMSF降低的氨基酸残基可视化；(c) NrfA/R-CDs复合物中氨基酸残基的结合自由能分解；(d) NrfA/R-CDs复合物的结合自由能(ΔG_vdw：范德华相互作用能；ΔG_ele：静电相互作用能；ΔG_solv：溶解能；ΔG_total：总结合自由能)；(e) MD过程中NrfA与R-CDs形成的氢键数量

图5 (a) R-CDs还原后的荧光强度变化；(b) NrfA/R-CDs的光电流强度；(c)添加NrfA前后的R-CDs的荧光寿命衰减曲线；(d) NrfA与R-CDs之间的直接电子转移机理

R-CDs与NrfA蛋白之间的界面光电子转移过程不仅为设计具有光电子存储与释放特性的新型纳米材料提供了理论指导，而且为进一步提高细胞水平的NH₄⁺合成提供了理论基础。