近日，大连理工大学环境学院常洋洋副教授等在化学领域著名学术期刊Angewandte Chemie International Edition上发表了题为“Converting One In Vitro Selected DNA Molecule into Two Bacteria-Responsive DNAzymes by Regulation of Reaction Conditions”的研究论文。本研究提出一石二鸟调控策略，利用两种细菌中核糖核酸酶（RNase）理化特性差异，通过精准调控一个DNA分子（brRFD2）的反应条件，分别实现对两种病原菌（肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌）的特异性识别。brRFD2在48份临床样本中表现出优异诊断效能，极大缩短检测诊断时间。
一、脱氧核酶体外筛选：通过体外筛选技术，获得了具备“一对二”识别能力的细菌响应型脱氧核酶。在pH 4.5条件下，brRFD2能够识别肺炎克雷伯氏菌（KP）和大肠杆菌（EC）并表现出显著的切割活性，二者表观速率常数kobs分别为0.074和0.04 min-1。（图1）
二、两种细菌区分检测：经靶标性质表征证实，KP与EC中均可产生激活brRFD2的RNase，且两类RNase理化性质存在明显差异。KP来源的RNase具备良好耐酸稳定性，在pH 3.6反应体系中可特异性激活brRFD2，实现对KP的精准识别，检出限为104 CFU/mL；EC来源的RNase则表现出优异热稳定性，经90 ℃高温预处理后仍可有效介导brRFD2切割，进而实现EC的专一性检测，检出限可达103 CFU/mL。（图2-4）
三、brRFD2序列保守性验证：利用Mfold软件对brRFD2进行二级结构模拟预测，解析了其行使酶切功能的关键结构域。通过序列截短与定点碱基突变实验，系统探究了各结构域的功能重要性。结果表明，除P1、J1/2及P2区域外，brRFD2其余所有结构单元均为维持高效催化活性所必需的。3’端完整结构与螺旋衔接区的碱基配对是维持brRFD2催化活性的关键；3’端序列不可或缺，而5’端部分序列存在结构冗余。（图5）
四、临床样本检测性能分析：探究了brRFD2对肺炎临床样本检测效能。建立痰液样本前处理与检测流程，并对48份住院患者样本开展双菌同步筛查。结果显示，以传统培养法作为金标准对照验证，brRFD2对KP检测灵敏度88.9%、特异度96.7%，对EC检测灵敏度与特异度均达100%，且可检出混合感染样本，证实该brRFD2在肺炎临床诊断中具有较强的应用潜力。（图6）
小结：本研究首次报道了仅通过调控反应条件，即可将一个DNA分子转化为可分别特异性识别KP与EC的脱氧核酶。在pH 3.6条件下，brRFD2对KP响应信号强、特异性高；在pH 4.5且靶标预加热条件下，则可专一识别EC。其检测灵敏度相较于现有一对一细菌响应型脱氧核酶提升十倍以上。基于brRFD2构建的一石二鸟检测策略，对48份肺炎患者的痰液样本中KP和EC均展现出优异的灵敏度与特异性。
本研究为细菌响应型脱氧核酶的设计提供了全新思路:（1）以往筛选获得的脱氧核酶多为“一对一”识别模式，仅靶向单一细菌；本研究证实：同一脱氧核酶序列可通过调控反应条件，分化为两种功能亚型，实现KP与EC的精准区分。该发现为研发“一对多”识别特性的细菌响应脱氧核酶提供了理论依据；（2）本研究建立的一石二鸟策略具备良好临床应用潜力。brRFD2不仅催化活性高与特异性强，还可在同一检测体系中同步筛查两种主要致病菌，大幅提升检测效率、简化临床诊断流程。基于该脱氧核酶研发快速便携的即时检测平台具备广阔前景，有望进一步拓宽其临床应用场景。同时brRFD2对耐药型、敏感型肺炎克雷伯氏菌菌株均具备切割活性，后续可依托该思路开发可鉴别耐药菌株的新型脱氧核酶，为临床抗生素精准用药提供指导。
本研究得到了国家重点研发计划（2024YFA0918900）、国家自然科学基金（22425602, 22476014）、大连市科技创新基金（2023YGZD08）、大连市科技人才创新支持计划（2024RJ001）以及高校学科人才引进计划（B25041）的支持。
图1. 细菌响应型脱氧核酶体外筛选及性能验证
图2. 细菌靶标性质分析
图3. 不同条件下brRFD2与细菌靶标的结合性能分析
图4. 不同条件下brRFD2对KP和EC的检测性能分析
图5. brRFD2二级结构及序列保守型分析
图6. 临床样本中brRFD2检测性能评估
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.7611103
