RNA修饰在生物体内具有重要的生物学功能，其中腺苷酸到肌苷酸的修饰（由ADAR酶催化）在神经系统、免疫反应和癌症生物学中发挥关键作用。传统的RNA切割脱氧核糖酶（RCD）通常在识别位点附近直接切割RNA，而具有空间分离的识别和切割功能域的RCD尚未被报道。

大连理工大学刘猛、张子杰团队通过体外筛选技术，从大量的DNA分子库中筛选出能够特异性识别肌苷修饰的RNA切割脱氧核糖酶RCD-I4T3。该酶具有独特的结构和催化机制，能够特异性识别RNA中的肌苷位点，并在距离肌苷8个核苷酸的下游进行切割。研究团队进一步优化了RCD-I4T3的工作条件，确定了其最佳反应温度、pH值和金属离子浓度，并通过一系列实验验证了其对肌苷修饰RNA的高特异性和高催化活性。此外，研究还通过质谱分析确定了RCD-I4T3的切割位点，并通过突变分析揭示了其功能区域。该工作以“Site-Specific Recognition of Inosine-Modified RNA by Deoxyribozyme with Distant Cleavage Site”为题，发表在Angewandte Chemie International Edition期刊上。

新型RCD的发现：首次发现了一种具有空间分离的识别和切割功能域的RNA切割脱氧核糖酶（RCD-I4T3），类似于Type IIS限制性内切酶和内切酶V，填补了该领域的空白。

高特异性和高活性：RCD-I4T3对肌苷修饰的RNA表现出极高的特异性和催化活性，其切割速率常数为1.9×10⁻² min⁻¹，比未修饰的RNA快95倍，展现出强大的RNA切割能力。

功能区域解析：通过系统突变分析，明确了RCD-I4T3中不同区域的功能，揭示了其独特的催化机制和肌苷识别机制，为后续的结构优化提供了理论基础。

应用潜力：RCD-I4T3能够有效识别和切割复杂的肌苷修饰mRNA片段，展示了其在RNA修饰分析、疾病诊断和生物医学应用中的巨大潜力，为相关研究提供了新的工具和思路。

图1：展示了体外筛选肌苷特异性RCD的工作流程，包括负选择和正选择步骤，通过逐步筛选获得高活性和特异性的RCD。

图2：展示了筛选过程中各轮次的反应时间和切割产率，以及第12轮筛选中排名前五的RCD序列及其活性。

图3：提出了RCD-I4的二级结构模型，并展示了其对肌苷修饰RNA的切割活性和动力学分析。

图4：通过质谱分析确定了RCD-I4T3的切割位点，并通过酶解实验验证了其切割产物的末端磷酸基团。

图5：总结了RCD-I4T3中每个核苷酸的功能重要性，区分了其催化活性和肌苷识别的关键区域。

图6：展示了RCD-I4T3对两个复杂mRNA片段（GABRA3和MED13）的切割效果，验证了其在复杂RNA结构中的应用潜力。

作者成功开发了RCD-I4T3——首个具有空间分离识别与切割功能域的DNAzyme，能够特异性识别RNA中的肌苷修饰并在其下游8个核苷酸处实现高效切割。该酶不仅展现出优异的催化活性（kobs = 1.9×10⁻² min⁻¹）和高特异性（95倍选择性），更通过模块化设计实现了识别与催化功能的解耦，为DNAzyme的理性设计提供了全新范式。系统性的突变分析进一步揭示了其L1环负责催化功能、L2环负责肌苷识别的明确分工机制，这在DNAzyme研究中尚属首次。展望未来，RCD-I4T3的模块化架构和独特的催化机制使其在多个领域具有广泛的应用前景。在诊断领域，它可以用于检测RNA中的肌苷修饰，帮助诊断与RNA修饰相关的疾病。在生物医学研究中，RCD-I4T3可以作为工具酶，用于研究RNA修饰的功能和调控机制。此外，其高特异性和高活性也使其在细胞成像和基因治疗中具有潜在的应用价值。未来的研究将致力于通过高分辨率结构分析（如X射线晶体学和NMR光谱）进一步阐明其分子机制，并探索其在不同生物医学应用中的潜力。

文章信息

S. Xiao, Y. Chang, P. Jia, et. al., Site-Specific Recognition of Inosine-Modified RNA by Deoxyribozyme with Distant Cleavage Site, Angew. Chem. Int. Ed., 2025, e202513587. https://doi.org/10.1002/anie.202513587